A técnica de
coloração de Gram é uma técnica de coloração diferencial que permite distinguir
os dois principais grupos de bactérias por microscopia óptica. Foi
descoberta pelo físico dinamarquês Hans Christian Gram em 1884. Este cientista
obteve com a coloração realizada uma melhor visualização das bactérias em
amostras de material infectado. Verificou, no entanto, que nem todas as
bactérias coravam com este método o que o levou a sugerir a possibilidade de
ser usado um contrastante. Gram morreu em 1935 sem ter conseguido que
fosse reconhecida a devida importância ao seu método de coloração.
Atualmente, esta técnica é fundamental para a taxonomia e identificação das
bactérias, sendo utilizada como técnica de rotina em laboratórios de
bacteriologia.
A técnica de coloração de Gram consiste em expor as células bacterianas
à seguinte sequência:
Corante primário – violeta
de cristal: cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de
célula.
Mordente – solução
de iodo: aumenta a afinidade entre o violeta de cristal e a célula e forma
com o corante um complexo insolúvel dentro da célula.
Agente descolorante – álcool,
acetona ou ambos: solvente lipídico.
Contrastante – safranina
ou fucsina básica: cora o citoplasma de vermelho.
O que se verifica, quando se observam as
diferentes bactérias sujeitas a esta coloração ao microscópio, é que estas têm
um comportamento diferente face à coloração de Gram, o que permite
classificá-las em:
Bactérias Gram-positivo (apresentam cor púrpura)
Bactérias Gram-negativo (apresentam cor vermelha)
Estudos de microscopia eletrônica e
análises bioquímicas permitiram concluir que a parede celular bacteriana é a estrutura responsável pelo
diferente comportamento das bactérias à coloração de Gram.
A
coloração de Ziehl-Neelsen baseia-se na capacidade de algumas bactérias
(microbacteria e actinomicetes) resistirem aos métodos comuns de coloração
devido à composição altamente lipídica da parede celular. Após um processo de
coloração especial a quente uma vez corada não sofre ação de descorantes fortes
como solução de álcool ácido. Desta forma, a fucsina de Ziehl cora todas as
bactérias de vermelho e após a descoloração com álcool – ácido somente os
bacilos álcool – acido resistente (b.a.a.r) conservarão esta cor. Para
facilitar a visualização cora-se o fundo com azul metileno, estabelece
contraste nítido entre elementos celulares e outras bactérias (azuis) e os
b.a.a.r (vermelhos).
Técnica de coloração :
1º Cobrir a lâmina com solução de Fucsina fenecida de azul
2º Com uma chama fraca sob a lâmina (de lamparina a álcool por exemplo) aquecer
suavemente até a emissão de vapores, durante 5 minutos. Evitar ebulição,
evaporação do corante.
3º Lavar rapidamente em água corrente.
4º Inclinar a lâmina e cotejar a solução descorante sobre o esfregaço, até que
não escorra mais liquido vermelho.
5º lavar em água corrente novamente.
6º Cobrir a lâmina com solução de azul de metileno deixar agir por 40 segundos
e 1 minuto.
7º lavar em água corrente e secar entre duas folhas de papel de filtro.
8º levar a microscópio para proceder a leitura.
Leitura e interpretação dos resultados:
Procede a leitura com o objetivo de imersão. Os bacilos álcool – ácido
resistentes aparecem como bastonetes finos vermelhos isolados ou agrupados,
encurvados e nodulados.
Técnica de confecção do esfregaço:
Fazer suspensão das bactérias – teste conforme a escala 0,5 mac Fariamil.
Fazer 2 esfregaço na mesma lâmina um de bactéria controle positivo, e outra de
contraste positivo , com alça 1:1000
Corar como de rotina.
Cuidados com a amostra
Por tratar–se de material clinico potencialmente contaminado, manusear todos os
testes de acordo com normas de biossegurança e utilizando equipamento de
proteção individual (luvas, avental e mascara), em luxo laminar.
Referências:
Disponível em:
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